溶磷脂酰乙醇胺通过促进ja信号和ros稳态来触发对坏死细胞的免疫

　　

　　

　　生物活性分子对植物防御反应的调节日益引起人们的兴趣。然而，尽管植物细胞脂质是主要的细胞成分之一，但它们在植物免疫中的作用仍然难以捉摸。我们发现，外源应用细胞膜定位磷脂溶磷脂酰乙醇胺(LPE)重编程植物转录谱，有利于防御相关基因，从而启动植物免疫系统。外源LPE施用于不同拟南芥材料中，可提高其对坏死性致病菌灰霉病菌和异养田鼠耳虫的抗性。我们发现LPE在茉莉酸(JA)受体突变体coi1中免疫促进作用被消除，但在茉莉酸敏感突变体feronia (fer-4)中增强。在LPE作用下，ja信号传导抑制因子JAZ1被降解，这表明LPE促进了ja信号传导。lpe处理后，coi1和fer-4中的活性氧(ROS)积累受到影响。此外，LPE应用后，RALF家族的FER信号抑制剂强烈表达，RALF23被内化到应激颗粒中，表明LPE通过促进RALF功能介导了FER信号的抑制。与内源性lpe缺失突变体pla2- α相比，lpe分解代谢突变体lpeat1和lpeat2中lpe丰度的原位增加提高了植物对灰孢杆菌的抗性。我们发现LPE通过促进ja信号和ros稳态来提高植物对坏死性营养物质的抗性，从而为LPE靶向作物基因组工程铺平了道路，以提高其抵抗生物威胁的能力。

　　植物的发育对环境变化的反应具有高度的可塑性。植物可以触发特定的分化程序，促进生长而不是分化，或者支持防御策略来应对生物胁迫。虽然植物整合环境和内源信号的分子机制尚不完全清楚，但植物信号通路的各个要素之间存在高度的保守性(Marin-de la Rosa et al. 2015)。

　　植物信号脂质包括大量的脂类，包括脂肪酸、磷脂酸、磷脂、二酰基甘油、氧脂、磷酸肌醇、鞘脂和n -酰基乙醇胺。磷脂参与广泛的生物功能，包括信号转导，能量储存，以及使细胞膜的结构动力学和完整性成为可能。

　　溶酶磷脂酰乙醇胺(LPE)是细胞膜定位脂质的一个次要成分，起源于前体磷脂酰乙醇胺(PE)。磷脂酶A2水解结构磷脂PE，从而生成LPE。磷酸乙醇胺是PE和磷脂酰胆碱(PC)的前体，限速酶磷酸乙醇胺CYTIDYLYLTRANSFERASE 1 (PECT1)调节拟南芥中PC: PE的比例(Canonne et al. 2011;Lee et al. 2005)。敲除PECT1会影响PC: PE比率，对PE不利(Mizoi et al. 2006)。两种酶LYSOPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE ACYLTRANSFERASE1 (LPEAT1)和LPEAT2用酰基辅酶A使LPE乙酰化(Jasieniecka-Gazarkiewicz et al. 2017)。LPEAT1和LPEAT2的破坏增加了叶片中LPE的含量。

　　拟南芥叶片脂质谱分析表明，PE约占叶片脂质总量的6.45%，LPE约占0.026%。LPE是一种甘油脂，外源应用于多种作物，如青椒、甜樱桃、草莓和西红柿(Farag & Palta 1993;Amaro & Almeida 2013;Ozgen et al. 2015)延缓早期衰老，同时加速果实成熟(Farag & Palta 1993;Ryu et al. 1997;Hong et al. 2009)。最近，我们发现外源LPE的应用增加了植物对半生物营养病原体丁香假单胞菌的抗性(Volz et al. 2021)。

　　在这里，我们发现lpe处理植物的转录谱富含免疫相关转录物。LPE调节ros稳态和ja信号，从而使植物受到坏死性入侵者的感染。

　　在寻找激活植物免疫系统的因子时，我们确定了细胞膜定位的磷脂LPE作为防御相关过程的假定增强剂。在接种灰霉病菌前24 h喷施LPE，测定了哥伦比亚(Col)和瓦塞列夫斯卡亚(Ws)两个拟南芥材料的病变形成情况。我们发现，LPE预处理后，Col和Ws在接种后72 h的病变形成(hpi)显著减少(图1A)。这一结果表明，LPE预处理干扰了葡萄球菌引发的植物细胞死亡和寄主定植。此外，我们分析了LPE预处理是否也促进了对坏死性病原体异strophus C4的抗性(Volz et al. 2020)。我们发现，与模拟处理的对照相比，两种拟南芥在72 hpi时病变形成减少(图1B)。这些结果表明LPE预处理对植物免疫有促进作用。

　　图1

　　

　　通过促进防御相关的转录基因谱，LPE应用增加了对灰葡萄孢和异养黄萎病的抗性。通过感染实验评价lpe对A、B免疫促进作用。2个拟南芥材料Columbia (Col)和Wasselevskaja (Ws)在LPE和模拟预处理后24 h分别感染灰霉病菌(Botrytis cinerea)和异strophcochliobolus heterostrophus。72hpi时分析病变形成及感染程度。误差条为±SD。进行了三次生物重复，结果相似。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义。C, D LPE处理后6 h和24 h的差异表达基因(DEG)谱图。deg可以分组在特定的集群显示lpe响应基因表达。E: LPE治疗后6小时基因表达上调有助于防御和免疫相关功能。F LPE处理后6 h基因表达下调有助于生长和代谢功能

　　为了阐明LPE处理可能调节的宿主分子过程，我们分析了LPE处理后6小时和24小时的转录谱，并与模拟处理的对照进行了比较。当考虑到所有检测到的转录本的表达谱时，模拟对6小时(0.932)，模拟对24小时(0.929)，6小时对24小时(0.859)获得了接近线性的相关系数(Pearson-correlation)(图1C, D)。严格的相关性表明，LPE不会以无偏的方式影响一般基因表达，而是影响特定生物过程中的基因子集。通过标准化FPKM值对差异表达基因(DEGs)进行分层聚类(p < 0.01)，揭示了LPE感知过程中基因表达模式的明显变化。我们发现，LPE给药后6小时，有1914个基因表达上调，1111个基因表达下调，24小时后，2938个基因转录水平升高，1659个基因表达水平降低(图S1A，表S1)。应用LPE后6小时上调的基因被归类为基因本体(GO)术语，显示对生物刺激、细菌、真菌损伤、几丁质和茉莉酸的上调反应(图1E, S1D)。值得注意的是，茉莉酸信号通路的标记基因PDF1.2a/b/c、PDF1.3、ORA59等转录水平显著升高，而与PTI应答、水杨酸和衰老相关的基因PR1、FRK1、WRKY53、SAG13和SAG21等转录水平也出现上调。相比之下，LPE应用后6小时下调基因的氧化石墨烯术语分析突出了基因在促进生长、发育和代谢过程中的功能(图1F)。

　　这一分析表明，LPE感知触发了有利于防御相关过程的调节途径，而不是植物生长。此外，LPE刺激了基因调控网络，有助于防御坏死性病原体。

　　此外，我们确定了氧化石墨烯相关基因的显著上调，这些基因描述了LPE应用24小时后肽代谢、盐胁迫反应、氧化应激老化和细菌中的基因功能(图2A，表S2)。而下调基因在发育和代谢过程、基因表达和生长素反应方面被归类为氧化石墨烯(GO)术语(图2B)。有趣的是，聚类分析显示，防御相关通路在6小时主要上调，随后在24小时主要下调(图2C)。我们发现在6 h时出现强烈上调峰的基因，其编码蛋白催化ja生物合成中的限速步骤(AOC1, AOC2, AOS, JOX4)和ja信号通路(ORA59, PDF1.2, JAZ6, PR4和WAX1)(图2C, D，图S1B)。LPE给药后6小时下调，24小时上调的基因参与小分子代谢和核苷酸过程，以及对光强和光合作用的响应(图2F, G，图S1C)。因此，可以得出结论，LPE主要针对JA和乙烯协调免疫修改转录谱，而促进代谢过程的基因表达谱被忽视。

　　图2

　　

　　lpe治疗改变了防御和生长相关的转录谱，有利于免疫相关的特征。LPE处理后24小时基因表达上调有助于防御和衰老相关功能。B LPE处理后24 h基因表达下调有助于生长和代谢功能。C, D LPE应用后的短期反应促进了防御相关基因的表达。误差条为±SD。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义。也见图S1B。E积累lpe的生物合成突变体lpeat1和lpeat2以及lpe缺失突变体pla2alpha感染葡萄孢菌后的敏感性分析。72hpi时分析病变形成及感染程度。误差条为±SD。进行了三次生物重复，结果相似。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义。F, G LPE应用后的短期反应抑制了特定生长和发育相关基因的表达。误差条为±SD。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义。同样，见图S1C。(H)应用LPE后0,0.5,6和24小时的map -激酶激活试验，与模拟处理的对照相比，评估MPK3和MPK6的激活情况。进行了三次生物重复，结果相似

　　为了分析LPE感知是否触发MAP激酶信号通路，我们分析了植物免疫中协调PTI和ETI的MPK3和MPK6的磷酸化(Meng & Zhang 2013)。先前的研究表明，磷脂，磷脂酸，结合并触发MPK3和MPK6磷酸化，以响应水下诱导的缺氧(Zhou et al. 2022)。这促使我们分析了lpe处理14天龄幼苗后0小时、0.5小时、6小时和24小时这些免疫MAP激酶的磷酸化情况(图2H)。与模拟处理的对照组相比，我们在指定的时间点未检测到MPK3和MPK6磷酸化状态的变化，这表明这些免疫相关的MAP激酶信号通路在lpe诱导的免疫中起次要作用。

　　我们质疑原位LPE水平的变化是否会根据外源LPE的施用增加植物的抗性。为了解决这个问题，我们分析了溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶1 (LPEAT1)和LPEAT2的突变体。研究表明，lpeat1和lpeat2突变体增加了LPE的原位稳态(Jasieniecka-Gazarkiewicz et al. 2017)。我们发现lpeat1和lpeat2缺陷植株感染灰绿杆菌后的抗病性比对照组增强(图2E)。相反，我们分析了在LPE生物合成中受损的磷脂酶2-ALPHA (PLA2-ALPHA)突变体和数量不足(Lee et al. 2010;王2005)。与WT、lpeat1和lpeat2相比，pla2- α突变体对葡萄球菌感染的易感性增加(图2E)。因此，我们发现，根据外源施用，原位LPE水平的增加降低了葡萄球菌感染植物的敏感性。然而，原位LPE水平的降低增加了宿主的易感性和脆弱性。综上所述，上述结果表明，原位LPE丰度的改变直接影响植物的抗性，就像外源给药一样。

　　LPE处理后的转录谱显示JA信号基因的富集，这些基因先前被证明可以促进防御反应。因此，我们分析了JA信号突变体在LPE预处理和灰绿杆菌感染后免疫促进作用的变化。我们鉴定了ja受体COI1的两个等位突变体(COI1 -21, coi22 (He et al. 2012))。在模拟预处理后，两种等位基因coi1突变体对灰绿杆菌的易感性均高于野生型。在LPE预处理后，可以在野生型中观察到灰绿杆菌感染的强烈下降(图3A)。然而，在LPE预处理后，两个等位基因coi1突变体都表现出对灰绿杆菌的易感性，这与coi1模拟处理的对照相对应，这表明ja信号传导对LPE的先天免疫启动效应至关重要(图3A, B)。为了进一步分析增加的ja信号传导是否可能促进LPE的免疫增强作用，我们纳入了fe -4突变体(Guo et al. 2018;Escobar-Restrepo et al. 2007)，以myc2依赖的方式表现出升高的ja反应。此外，我们还分析了WT植物中由COI1启动子驱动的COI1过表达系(coi10x)。经模拟处理的fe -4和coi10x系对绿僵菌的敏感性降低。在LPE预处理后，我们有趣地发现，与LPE预处理的WT植株相比，coiox和fer-4对灰葡萄球菌感染的抗性进一步增强(图3B)。综上所述，LPE预处理的免疫促进作用依赖于ja信号和应答。为了分析LPE对JA-和et信号通路的影响，我们研究了这些信号通路中涉及的关键因素对其蛋白质稳定性的影响。首先，我们分析了et信号通路中关键的转录因子乙烯不敏感3 (EIN3)。在没有乙烯的情况下，EIN3被26S蛋白酶体降解(Heydlauff et al. 2021;粘结剂2020)。在ET存在的情况下，EIN3被稳定并促进ET信号转导。我们发现在应用et前体ACC后，由EIN3启动子驱动的EIN3:GFP (Volz et al. 2013)稳定(图4B, C)，然而，在模拟和LPE处理后，我们无法检测到EIN3稳定，这表明应用LPE对et产生和信号传导的影响很小。其次，我们分析了ja信号通路的组成部分。JA信号抑制因子JAZ1在高JA水平下被降解，并通过靶向MYC2在JA默认水平上抑制JA信号传导(Grunewald et al. 2009)。与模拟处理相比，我们发现LPE和JA处理后JAZ1:GFP降解(图4A, C)。这一结果表明，LPE触发26S蛋白酶体介导的JAZ1降解，从而促进ja信号传导。

　　图3

　　

　　茉莉酸信号突变体在lpe预处理后对葡萄孢杆菌感染表现出明显的易感性。A, B .描述了利用各种激素突变体促进茉莉酸信号传导的感染实验。在lpe预处理后24 h和灰霉病菌感染后72 h，分析了ja -受体COI1 (COI1 -21、COI1- 22)、COI1过表达系(coi10x)、ja -敏感突变体feronia (fer-4)和铁互补系的两个等位突变体。误差条为±SD。进行了三次生物重复，结果相似。误差条为±SD。进行了三次生物重复，结果相似。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义

　　图4

　　

　　LPE的目标是RALF23-FERonIA信号模块。A, C与GFP连接的ja -阻滞物JAZ1 (JAZ1:GFP，黄色箭头)在lpe处理和ja -应用1小时后降解。采用单因素方差分析(单因素方差分析)B, C。乙烯信号组分关键因子EIN3的蛋白稳定性不受lpe应用的影响。相比之下，乙烯前体ACC在给药后1 h触发EIN3的降解。在lpe作用后0 h、6 h和24 h, ja信号组分和FERONIA-RALF信号复合物成员的转录谱存在差异表达。E转基因拟南芥稳定品系施用LPE-和ja - 1 h后RALF23-RFP的蛋白定位。lpe治疗后，RALF23-RFP内化于细胞内斑点(黄色箭头)。在模拟处理条件下，RALF23-RFP定位于质膜。进行了三次生物重复，结果相似。图像内的细灰色条是指用于荧光强度测定的区域。F, G lpe处理后24 h FERonIA (FER)信号抑制因子RALF22、RALF23、RALF24、RALF32、RALF33以及FERonIA信号启动子RALF1和FERonIA的定量PCR。误差条为±SD。进行了三次生物重复，结果相似。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义。

　　RALF组的肽激素参与多种生物信号传导过程(Xiao et al. 2019)，例如，抑制feronia介导的MYC2降解，从而促进ja信号传导和反应(Guo et al. 2018)。

　　有趣的是，我们发现ralf的一大亚类(RALF22, RALF23, RALF24, RALF32, RALF33, RALFL)在LPE应用24小时后上调(图4D, F, G)。RALF22和RALF23在抑制fer介导的myc2降解中发挥关键作用，有利于ja信号传导。相比之下，在给药LPE后，FER及其在ripk介导的rpm1诱导免疫中的相互作用伙伴RALF1被强烈下调(图4D, G)。同样，几个靶向myc2的ja信号抑制剂JAZs成员(如JAZ1, JAZ2, JAZ6, JAZ12)在LPE处理后显示转录量减少(图4D)。

　　研究表明RALF23抑制FER功能，从而支持myc2介导的ja反应(Guo et al. 2018)。ferr - ralf模块协调细胞壁传感，进而影响其亚细胞定位以响应各种应力(Herger等人，2019;Zhao et al. 2018)。因此，我们分析了LPE、JA和模拟治疗后与RFP相关的RALF23的定位。我们发现，在LPE和JA处理后1小时，RALF23内化在细胞内斑点中(图4E)。这一结果表明ferr - ralf23信号模块参与了lpe响应的分子过程。

　　原位活性氧(ROS)稳态的升高和ROS的爆发是在感知到病原特征后对病原威胁作出反应的第一步(Nakagami et al. 2005)。在这方面，ja介导的防御反应与ROS稳态的变化密切相关，以对抗坏死性入侵者(Stenzel et al. 2003)。我们之前的研究表明，LPE增加了原位过氧化氢H2O2水平，同时强烈诱导H2O2诱导基因表达(Volz et al. 2021)。

　　在这里，我们通过进行3,3-二氨基联苯胺(DAB)组织化学染色，分析了WT、coi1-21和fer-4在LPE预处理后的不同防御反应是否可以追溯到它们的适应性h2o2稳态差异。在LPE处理24小时后，与模拟处理相比，WT中的ROS水平，特别是fe -4中的ROS水平显著增加(图5A, B)。然而，我们无法检测到LPE处理后coi1中ROS积累的变化，从而表明ja信号通路有助于LPE触发的ROS稳态变化。

　　图5

　　

　　活性氧对LPE的免疫促进作用至关重要。A, B在LPE应用后，WT, coi1-21和fe -4中不同的原位过氧化氢水平。ros强度单位(任意)采用ImageJ进行定量。采用单因素方差分析分析差异有统计学意义

　　摘要。

　　关键信息

　　介绍

　　结果

　　讨论

　　材料与方法

　　数据可用性

　　参考文献。

　　作者信息

　　道德声明

　　相关的内容

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　　利用生物活性分子修饰植物的防御反应是一个重要的研究领域。然而，细胞膜脂质在植物免疫中的作用尚不清楚。我们发现细胞膜定位的磷脂LPE促进防御相关基因的表达并启动植物免疫系统。植物细胞壁是坏死性病原体的主要碳源之一。为了穿透这些屏障并从植物细胞中吸收更多的营养，病原体通过分泌角质酶和其他细胞壁降解酶来吞噬宿主。脂质启动是指某些脂质(如LPE)或脂质衍生分子作为信号分子，使植物的防御系统对潜在威胁(如病原体攻击)做出更快、更强的反应的过程。这种现象是植物免疫反应的重要组成部分，被认为是植物防御的一个关键方面。众所周知，参与脂质启动的脂质信号分子之一是茉莉酸，它是一种从脂肪酸氧化中提取的氧脂素(Wasternack 2007;Wasternack & strad 2016)。当植物受到各种生物(病原体、昆虫)和非生物胁迫(机械损伤、环境因素)时，就会产生氧化脂素。氧化脂素在防御反应的信号传导和调节中起着至关重要的作用，包括防御相关基因的激活、抗菌化合物的合成以及植物细胞壁的强化以防止病原体的入侵。植物病原体通常必须克服这些脂质介导的防御反应才能建立成功的感染。研究人员研究了脂质启动背后的机制，以及不同的脂质如何与植物的防御信号通路相互作用，以深入了解开发更强大和可持续的作物保护方法。

　　LPE的施用增加了拟南芥对坏死性真菌B. cinerea和C. heterostrophus的抗性，但这种效应在coi1中被消除，在fe -4突变体中被放大。LPE通过降解JAZ1促进ja信号传导，而ros稳态是LPE介导的免疫所必需的。LPE也可能通过促进RALF功能来抑制fer信号传导。我们的研究结果表明，LPE通过影响FERONIA-COI1介导的ja信号和ros稳态来触发免疫相关信号。

　　脂质引发的概念在农业中具有广阔的应用前景。通过向作物注入茉莉酸或其类似物，农民可以提高作物对病原体和害虫的抵抗力，减少对化学农药的依赖，促进可持续农业实践。通过基因工程改造作物原位LPE稳态，可以提高作物的抗逆性。为了挑战这一概念，我们分析了受LPE生物合成和分解代谢影响的突变体。LPEAT1和LPEAT2的破坏导致原位LPE水平升高。反之，我们分析了磷脂酶2alpha突变体(pla2alpha)，它的水平和LPE的产生都存在缺陷。杆菌感染后，我们检测到lpeat1和lpeat2的病变形成减少，抗性增加。相比之下，pla2alpha表现出更强的病变形成和更低的抵抗力。综上所述，我们发现原位LPE水平的增加与外源性LPE的应用相一致，具有免疫促进作用。重要的是，这些研究表明，对作物(如水稻)的LPE水平进行基因组工程可能是进一步研究的可取之处。我们预计，具有较高lpe稳态的作物可能在恶劣环境中耐受生物威胁和非生物胁迫。因此,它可能是可取的生成水稻,缺乏LPEAT1和LPEAT2增加现场LPE的水平,并研究其抗生物威胁,如b .灰质Magnaporthe oryzae,和c heterostrophus。

　　拟南芥生态型Columbia (Col-0)和Wassilewskija (Ws-0)来源于美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心(ABRC)。除了这些生态型外，我们还使用了以下从Col-0衍生的突变体和标记系:coi1-21 N68754, coi11-22, fer4 N69044, lpeat1 GK-825D08, lpeat2 SALK_107699C, pla2-aplha SALK_099415C, coi10x N2105631，。p35S::JAZ1:GFP N799800由NASC订购。

　　拟南芥生长在商品盆栽土和珍珠岩(3:1)的混合物上，或在Murashige和Skoog (MS)琼脂培养基上，在16/8 h日夜光周期、22°C和80%相对湿度的生长室中生长。

　　在土壤中生长并从底部灌溉4 ~ 5周的拟南拟南植物，在接种病原菌前24小时喷洒250 ppm Tween 80的模拟溶液或250 ppm Tween 80的50 ppm LPE (50 mg/l)溶液。然后将植物置于罩下，并在生长室中保持22°C的温度。

　　每个实验用25%甘油中- 80℃保存的孢子原液制备灰葡萄孢孢子。将孢子均匀铺在PDA培养基上，24℃培养14 d。收获后，用血细胞计测定孢子浓度。叶片接种4μl孢子悬浮液(5 × 105孢子/ml)，感染后72h (hpi)分析。每种植物基因型至少30株，在3个生物重复中取样。

　　Cochliobolus。在22℃的蔗糖脯氨酸琼脂培养基上培养异养孢子(C4-Tox1 +;MAT-2)分生孢子。在4周龄的拟蓝芽孢杆菌(a.t aliana)植株上接种异养拟蓝芽孢杆菌(C. heterostrophus)，方法是在蔗糖脯氨酸琼脂培养基上收集真菌培养的分生孢子，并将其浓度调整为5 × 105个/ml。使用连接到压缩机的空气刷将共20毫升的分生孢子悬浮液喷洒在五株植物上。接种植株在25℃、100%相对湿度的露室中培养16 h，然后转移到22℃、80%相对湿度的生长室中观察病害的发生。每次接种试验重复3次。为了评估疾病的严重程度，采用了基于病叶面积百分比(DLA)的数值评分系统。采用ImageJ软件根据接种后3和6 d (dpi)的亮度强度值测定DLA。DLA评分范围从0到5,0表示叶片上没有坏死或褪绿斑点(水分对照评分为0)。数值对应于显示坏死或褪绿的叶面积百分比，1代表1 - 20%，2代表21-40%，3代表41-60%，4代表61-80%，5代表81-100%。

　　在半ms培养基上培养14天的幼苗，提取核蛋白。用Bradford法对蛋白进行定量，等量的蛋白用SDS-PAGE分离。然后使用Mini-Protean 3 Cell (Bio-Rad)将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)上。采用浓度为1μg/mL的pTpY多克隆一抗进行免疫印迹分析，随后采用结合碱性磷酸酶的二抗进行免疫印迹分析。化学发光法检测抗体复合物，使用immune - start AP Substrate kit (Bio-Rad)。实验重复了三次，显示了一个bioRep的代表性结果。

　　为了测量提取物中的蛋白质水平，并保证免疫印迹分析中使用的凝胶中所有蛋白质的均匀负载，使用Bradford测定法。

　　从不含STOP密码子的拟南芥幼苗cDNA库中扩增出RALF23的编码序列，并克隆到基于gateway的penr - d - topo载体中。测序完成后，将其克隆到pDEST::C-RFP-Stop质粒中，生成pDEST::RALF23:RFP。随后，利用pDEST::RALF23:RFP利用农杆菌介导转化拟南芥植株。

　　采用3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB)进行组织化学染色，在LPE (50 mg/l)或模拟溶液处理的4周大的拟蓝植物中进行H2O2的原位检测，按照先前描述的方案。简而言之，将叶片在DAB溶液(50 mg DAB, 130 mg Na2HPO4, 0.01%v/v Tween 20)中孵育6小时，然后将叶片置于20%甘油中。这个实验重复了三次，得出了一个有代表性的结果。

　　为了分析单个标记基因的表达水平，在pH为5.7的培养皿中，对生长在含有半强度Murashige和Skoog (MS)， 0.5%蔗糖，1%琼脂和0.5% MES的培养基上的植株进行了RT-PCR。使用easy-spinTM总RNA提取试剂盒从LPE (50 mg/l)和模拟处理的14日龄幼苗中提取总RNA。使用Superscript II逆转录酶进行反转录，使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR systemTM和SYBR绿色PCR主混合物进行RT-qPCR。数据从至少三个生物重复的重复中取平均值，并使用寡核苷酸来确定转录水平。

　　RV4s

　　GAATCGGTCGTTTGGTTGCTA

　　qPCR GADPH

　　RV4as

　　TTAACAGCGACGAGCTCAACAT

　　qPCR GADPH

　　RV15s

　　GTACCGCCGTCTAAGGACAT

　　qPCR AOC2

　　RV15as

　　CACAGCGATACGAGAAACATT

　　qPCR AOC2

　　92年代

　　CGTTGTTCAAGCACCAGAGA

　　qPCR MEE14, CBP1

　　92年

　　CGGATTCGGCTTTTTCAATA

　　qPCR MEE14, CBP1

　　93年代

　　CGTACGTGAATGGCAAGCTA

　　qPCR NAD(P) BP AT2G29170

　　93年

　　GGCAACGTTTTCCATGAGTT

　　qPCR NAD(P) BP AT2G29170

　　94年代

　　CGTGGCTCGTGTGATAAAGA

　　qPCR SAG29

　　94年

　　CGGCGCTTATAGTGAGGAAG

　　qPCR SAG29

　　95年代

　　TGCTTACGTTGGACAGCTTG

　　qPCR NPF6

　　95年

　　ACTCACGAAGAATCCCATCG

　　qPCR NPF6.4

　　96年代

　　CGGCTTTTGCTTAGTTCCTG

　　qPCR COL7 - CONSTANS-LIKE

　　96年

　　CCATGATTGCCTTCTCGACT

　　qPCR COL7 - CONSTANS-LIKE

　　165年代

　　TCGCCGTATCTTCTCAATCC

　　qPCR RALF23_

　　165年

　　CAGAGCACTCGGCAATTGTA

　　qPCR RALF23_

　　166年代

　　TCTCCGTCACAGTTCCGATT

　　qPCR RALF24_

　　166年

　　ATCTCCGATGGCATCATCTC

　　qPCR RALF24_

　　167年代

　　AACAGTGTGCCTTGTTCACG

　　qPCR_RALF22_

　　167年

　　CTGTAAGGATTCGCCTGAGC

　　qPCR_RALF22_

　　168年代

　　TCTTGGTCAAGCCAGAGGTT

　　qPCR_RALF32_

　　168年

　　AAGACTCGCCTCGTTTACCA

　　qPCR_RALF32_

　　169年代

　　ACTCTCCACAAAACCCGTTG

　　qPCR_RALF33_

　　169年

　　CGACTCGATCGGTACGAAAT

　　qPCR_RALF33_

　　173年代

　　GGCGTTGTTCTATTCGAAGC

　　qPCR Feronia

　　173年

　　TGTTCCTTTGCAAGTGTTGG

　　qPCR Feronia

　　174年代

　　CGACTGGAGACAATGGTTCA

　　qPCR RALF1

　　174年

　　TTGTGGTCGCCAATATTCTTC

　　qPCR RALF1

　　182

　　ACGGTCTCAACGCTACCAAC

　　fer-4基因分型

　　183

　　TTTCCCGCCTTCGGTTTA

　　铁的T-DNA

　　184年代

　　GATTACTCTCCAACAGAGAAAATCCT

　　fer-4基因分型

　　184年

　　CGTATTGCTTTTCGATTTCCTA

　　fer-4基因分型

　　185年代

　　CTG TAA GCA GTT棉酚GCG GCT GAG手枪TGA

　　coi1-22

　　185年

　　GTC, GTC, GTC, GTC, GTT, GTT, GTT, TGG

　　coi1-22 BamH1

　　186年代

　　Gac - aac act TGT - TGT - TTT - TGT - Gac - gaa - TGT - aac CG

　　coi1-21

　　186年

　　GGT, GGT, GGT, GGC, GGC, GGT, GGT, GGT

　　coi1-21 HpaII

　　232年

　　TTATCACCGACCATTGTTGCATCG

　　lpeat2突变体，SALK_107699C

　　233年

　　TGCTCCAACTATTATGCTTTTTCCAG

　　lpeat1突变体GABI_825D08

　　234

　　CCATATTGACCATCATACTCATTGC

　　T-DNA左边界;pAC161)

　　235

　　CAAGTGGATTGATGTGATATCTCC

　　T-DNA右边界;pAC161)

　　236年代

　　AAAGTCATGTAGCCTAACACGTC

　　Lpeat2突变体，结合在9号。外显子，含有232as

　　237年代

　　TTTGACTAAGATTACCATTGAGAG

　　Lpeat1突变体，结合在9号。外显子，含有233as

　　238年代

　　tcgatatacagaagttctttgagc

　　T-DNA鉴定ATSPLA2-ALPHA, AT2G06925

　　238年

　　ttagccatacgaaacaaatgagtc

　　T-DNA鉴定ATSPLA2-ALPHA, AT2G06925

　　RNA测序使用Illumina测序仪(NICEM, Seoul, Korea)。使用FastQC v0.11.9 (Andrews 2017)检查原始序列读取的质量，并使用Fastp v0.20.1 (Chen et al. 2018)去除适配器和不良读取。使用HISAT2 v2.1.0比对器将质量检查的读数映射到参考基因组TAIR10 (Kim et al. 2019)。在Picard v2.23.3 (Broad Institute)中使用SAMsort对映射的读取进行排序。使用StringTie v2.1.3进行读取计数(Pertea et al. 2015)，使用DESeq2进行差异表达基因分析(Love et al. 2014)。基因本体富集测试在AgriGO v2.0中使用TAIR10数据进行(Tian et al. 2017)。模拟、6 h和24 h进行3次生物重复分析。

　　统计学显著性采用单因素方差分析和Tukey后验。显著性水平设为p≤0.05，柱上不同字母表示差异显著。共享字母的样本没有显著差异。用星号表示显著性水平，n.s.表示无显著性结果，*表示p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。

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